Il suo pontificato, considerato uno dei più significativi della storia del papato in età moderna, attuò una serie di riforme Cura pastorale nello spirito dell'illuminismo cattolico.
Uomo politicamente realista e moderno nell'affrontare i rapporti con gli ateismo e coi non cattolici, Benedetto XIV mise in pratica una serie di decreti volti a colmare le lacune politico-amministrative lasciate dai pontefici precedenti.
Fautore di un mecenatismo non soltanto Umanesimo cristiano, ma anche scientifico, papa Lambertini mutò atteggiamento a partire dagli anni 1750, quando si fecero sempre più allarmanti le tendenze Anticlericalismo dell'illuminismo, il quale vedeva come suo principale antagonista l'ordine dei Compagnia di Gesù.
Oggetto di una vivace disputa storiografia, divisa tra storici favorevoli al papa bolognese per il suo spirito profetico nell'amministrazione della Chiesa, e Intellettuale critici nei suoi confronti per la sua arrendevole politica concordataria, papa Lambertini è rimasto noto perlopiù al grande pubblico per la commedia Il cardinale Lambertini del bolognese Alfredo Testoni, in cui il commediografo mise in risalto il carattere "Conformismo" che contraddistingueva il Lambertini storico.

Prospero Lorenzo Lambertini nacque a Bologna in via delle Campane, poi intitolata a suo nome, il 31 marzo 1675 da Marcello Lambertini e Lucrezia Bulgarini, figlia di Carlo.
Prospero apparteneva, attraverso il padre, al ramo cadetto di un'antica famiglie senatorie bolognesi di Bologna, fino all'Risorgimento la seconda città per importanza dello Stato Pontificio.
Battezzato il giorno stesso della nascita da Carlo Evangelista Graffi, prevosto della Cattedrale di San Pietro (Bologna), il futuro pontefice rimase presto orfano del padre (deceduto a soli 42 anni.), mentre la madre convolò a seconde nozze col conte Luigi Bentivoglio. e morì il 21 novembre 1705.
Prospero apprese i primi rudimenti da Paolo Pasi e dal sacerdote Sante Stancari, per essere poi trasferito nel convitto bolognese dell'Accademia degli Ardenti, detto Del Porto.
A tredici anni fu infine mandato nel 1688 a Roma nel Collegio Clementino diretto dai Chierici regolari di Somasca.., ove si segnalò per vivacità d'ingegno fra i condiscepoli.

Il giovane Lambertini fu notato nel 1691 da papa Innocenzo XII, il quale, dopo aver ascoltato un discorso in latino redatto dallo stesso Lambertini sulla Trinità (cristianesimo) e a lui dedicato, ne fu talmente stupefatto che gli assegnò un piccolo beneficio che rendeva cento Scudo (moneta) d'oro, la prima delle gratificazioni ricevute dal pontefice nel corso della sua vita antecedente l'ascesa al Soglio.
Nel 1694 si laureò in teologia e in utroque iure presso l'Università degli Studi di Roma La Sapienza, avviandosi presto e con molti apprezzamenti alla carriera curiale, che percorse in tutti i suoi gradi e uffici divenendo nel 1708 Advocatus diaboli, nel 1712 Canonico della Basilica Vaticana con prebenda teologale e nel 1713 prelato, per poi divenire nel 1718 Segretario della Congregazione del concilio.
Il Lambertini fu tenuto in grande stima dal pontefice in carica, papa Clemente XI (1700-1721), il quale chiedeva consiglio al prelato nelle questioni più gravi e onerose, quali quelle relative al diritto canonico, ramo in cui il Lambertini eccelleva.
Il successore di Clemente XI, papa Innocenzo XIII, gli offrì il posto di Diritto canonico della Penitenzieria Apostolica.

Il Lambertini fu ordinato presbitero il 2 luglio 1724, all'età di quasi cinquant'anni, quando era già all'apice della carriera curiale.
Grazie a papa Benedetto XIII, che lo teneva in alta considerazione, salì rapidamente i gradi della gerarchia ecclesiastica, diventando vescovo il 16 luglio dello stesso anno. e Vescovo titolare di Sede titolare di Teodosia nel 1725. Dopo essersi servito dei suoi illuminati consigli nel Concilio straordinario romano del 1725, riguardante la disciplina ecclesiastica, papa Benedetto XIII lo creò cardinale (in pectore il 9 dicembre 1726 e pubblicamente il 30 aprile 1728) e quindi Arcidiocesi di Ancona-Osimo. il 29 gennaio 1727. In questa sede il Lambertini mise in mostra le sue prime grandi qualità umane e pastorali, curando i Seminario e il rapporto diretto con i propri fedeli..

Papa Clemente XII, nel concistoro del 30 aprile 1731, nominò Prospero Lambertini Arcidiocesi di Bologna., sua città natale, ove entrò il 29 maggio del medesimo anno..
Le capacità diplomatiche già dimostrate dal Lambertini in occasione del Concordato con le monarchie Regno delle Due Sicilie e Regno di Sardegna (1727), infatti, lo rendevano il candidato più adatto ad affrontare con successo i difficili rapporti col Senato cittadino, che caratterizzavano la forma diarchica di governo di quella città., riuscendo a normalizzare i rapporti fra quest'organo e la curia diocesana.
Proprio per il suo zelo nel mantenere buoni i rapporti col Senato, molti canonici e chierici bolognesi criticarono l'operato dell'arcivescovo in quanto andava a minare, nel contempo, i privilegi di cui essi avevano finora goduto.
Il Lambertini, per esempio, usufruì dei surplus di cui godevano gli ecclesiastici per attuare lavori di pubblica utilità, quali la pavimentazione delle strade..

A Bologna Prospero Lambertini promosse le arti e la scienza (costituzione dell'Accademia di belle arti di Bologna, così chiamata in onore del papa regnante Clemente XIII; fondazione dell'Istituto di scienze.) e ottenne che la seconda donna laureata al mondo, Laura Bassi, insegnasse nell'Università di Bologna.
Tra le altre iniziative, si adoperò per l'archiviazione e la sistemazione della biblioteca personale del predecessore Gabriele Paleotti.

Il Lambertini fu anche mecenate, commissionando la ristrutturazione di chiese o edifici sacri: sovvenzionò la riedificazione della Collegiata di San Biagio (Cento) e della Cattedrale di San Pietro in Bologna (questa tra il 1743 e il 1755), donando a quest'ultimo edificio sacro e al tempio bolognese di Basilica di San Petronio. preziose suppellettili sacre; continuò inoltre la costruzione del santuario della Madonna di San Luca (avviato nel 1723 e terminato nel 1757).

Il 6 febbraio 1740 papa Clemente XII, ormai infermo da molti anni, venne a mancare.
Il conclave che si aprì il 19 febbraio risultò uno dei più aspri di tutta la storia moderna: la fazione filo franco-austriaca e quella filo-spagnola continuavano a scontrarsi e a non trovare un'intesa su un candidato gradito a entrambi gli schieramenti.
Dopo la caduta delle candidature di Neri Corsini (cardinale) e di Annibale Albani, il collegio cardinalizio cercò di trovare un candidato nella figura di Pompeo Aldrovandi, ma questi non riusciva a superare il quorum necessario per essere eletto sommo pontefice.
Il cardinale Lambertini, che non era stato preso ancora in considerazione come candidato, cercò di smuovere le acque dicendo ai cardinali, con quello spirito scherzoso che lo contraddistingueva: «Volete un santo? Scegliete Vincenzo Ludovico Gotti. Volete uno statista? Eleggete Aldobrandini. Volete un uomo onesto? Eleggete me».

Che sia vero o no questo aneddoto, i cardinali convennero nel far convergere i voti sul neutrale arcivescovo di Bologna. Questi fu eletto al soglio pontificio il 17 agosto 1740, nonostante non desiderasse quella carica.
Al momento dell'elezione, infatti, rivolse ai cardinali le tre seguenti motivazioni, che sancivano la sua pur riluttante accettazione del soglio di Pietro.
Il Lambertini fu poi incoronato papa il 22 agosto. dal Cardinale Carlo Maria Marini, prendendo il nome di Benedetto in onore di Benedetto XIII, al quale doveva la sua carriera ecclesiastica.

Non appena ascese al trono papale, il Lambertini trovò una situazione economica disastrosa.
Cercò quindi di riorganizzare le finanze e di tutelare la sicurezza pubblica, ordinando la ridefinizione dei confini dei rione nei quali era suddivisa la città di Roma e affidando all'architetto Giovanni Battista Nolli da Como l'incarico di disegnare una pianta accurata della città, cosa che avvenne nel 1748.
Già prima di quell'anno, però, il Lambertini provvide ad identificare i rioni con delle apposite targhe e ad incaricare Gregorio Roisecco della stesura della prima guida turistica dell'Urbe, edita nel 1745 in tre volumi, col titolo Roma antica e moderna.
Sul piano più strettamente amministrativo Benedetto XIV individuò, come causa principale del dissesto finanziario dello Stato Pontificio, la cattiva amministrazione di una curia cosmopolita e corrotta.
Il Papa intese quindi favorire, attraverso la nazionalizzazione delle cariche civili, le famiglie romane che conoscevano i problemi dello Stato e che avevano interesse a garantirne lo sviluppo e la buona amministrazione
Per questo, con la bolla pontificia Urbem Romam, promulgata il 4 gennaio 1746, papa Benedetto istituì un Patrizio (storia romana), in cui vennero inserite 180 famiglie romane. Tra queste famiglie vennero scelti 60 capifamiglia, i cosiddetti "LX Patrizi Coscritti", il cui insieme costituì il patriziato romano

Benedetto XIV, con la bolla Peregrinantes, promulgò per il 1750 il Giubileo universale della Chiesa cattolica.
Quest'ultimo fu improntato ad un profondo clima spirituale (il papa chiamò Leonardo da Porto Maurizio a predicare), senza però quelle teatralità che davano alle funzioni religiose un'aura di bigotteriaBenedetto XIV
«...combatte certe teatralità nelle funzioni religiose e le proibisce in una serie di notificazioni"...» in base allo spirito di riforma liturgica che stava promuovendo in quegli anni.
Il Pontefice curò ogni singolo dettaglio dell'anno santo, stabilendo le principali iniziative spirituali (tra cui anche l'unità dei cristiani), organizzando le strutture ricettive (l'ospitale della Trinità accolse, su disposizione del papa, per tre giorni i pellegrini poveri) e accogliendo lui stesso i pellegrini che giungevano nella città eterna.
Strettissimo fu il rapporto che ebbe con il già citato San Leonardo: già presente a Roma nel luglio del 1749 per tenere dei sermoni sulla penitenza e sulla conversione del cuore, il predicatore francescano si recava ogni domenica dal Papa.
Benedetto, secondo il suo stile consueto, era solito sbalordire partecipando lui stesso agli incontri che teneva il frate.
Sempre sulla spinta di San Leonardo, Benedetto fu il primo pontefice a istituire la Via Crucis (pratica quotidiana per la vita spirituale del frate) al Colosseo, monumento che Benedetto volle preservare dallo smantellamento progressivo (veniva utilizzato come cava di marmo) consacrandolo in quanto luogo di martirio dei primi cristiani.
A segno di questa consacrazione (la Via Crucis si tenne il 27 novembre dell'Anno Santo), il Papa pose nell'arena una croce con 14 edicole della Via Crucis, che verranno tolte nel 1874.
La sola croce verrà ripristinata nel 1925.

Primo dopo molti secoli, Benedetto comprese l'importanza dello sviluppo della scienza, perché potesse diventare strumento per il miglioramento materiale dell'umanità. Papa Lambertini continuò, inoltre, anche il patronato nei confronti delle medicina, fisica e astronomia già perseguite durante il periodo in cui fu arcivescovo di Bologna. Nel 1748, oltre alla Bassi, invitò a insegnare a Bologna anche la matematica milanese Maria Gaetana Agnesi e nel 1757 aprì nella sua città natale la prima cattedra di ostetricia in Italia, chiamando come insegnante Giovanni Antonio Galli.

Benedetto nominò 64 nuovi cardinali nel suo quasi ventennale pontificato, durante sette concistori.

Il 1758 vide un rapido esaurimento delle energie fisiche dell'anziano pontefice, che aveva raggiunto la ragguardevole età di 83 anni.
All'inizio dell'anno fu afflitto da un attacco di gotta, dalla quale sembrò essersi ripreso verso febbraio.
Verso la fine di aprile, però, si ebbe il definitivo tracollo e il 3 maggio Benedetto XIV morì.
Al momento della morte, si dice che egli abbia pronunciato la famosa frase latina: sic transit gloria mundi, cioè "così passa la gloria del mondo", nella consapevolezza che la sua opera riformatrice non sarebbe stata compresa dai suoi successori..